A Vatikáni Könyvtárban található a világ egyik legértékesebb kézirat- és könyvgyűjteménye. Itt őrzik többek között az Újszövetség két legjelentősebb görög kéziratának egyikét, a IV. századból származó Codex Vaticanus B-t.

A gyűjtemény eredete a pápaság kezdetéig nyúlik vissza, hivatalosan 1450-ben alapította V. Miklós pápa (1447-1455). Falai között 1,6 millió antik és modern könyvet, köztük 8300 ősnyomtatványt, számos pergament, 150 ezer kéziratot, százezer nyomtatott dokumentumot és metszetet, 300 ezer pénz- és egyéb érmét, 20 ezer művészeti alkotást őriznek.

A 2007-ben felújítási munkálatok miatt bezárt könyvtárat várhatóan ősszel nyitják meg újra.